El aislamiento de cepas bacterianas autóctonas con capacidad de remoción de COP y productoras de ramnolípidos se realizó mediante la técnica de enriquecimiento secuencial utilizando compuestos oleosos como única fuente de carbono (figura. 1). En el caso de las rizobacterias, se realizó a partir de una suspensión, en agua estéril, de la tierra que rodeaba las raíces de plantas colectadas en suelos contaminados por hidrocarburos. Las cepas se identificaron utilizando pruebas bioquímicas clásicas para determinar el género y la especie según el Manual Bergey’s. ³

Para la selección de las bacterias productoras de ramnolípidos se utilizaron los métodos Agar azul, ⁴ Gota colapsada ⁵ y Aceite difundido ⁶ y se determinaron parámetros físico-químicos y estructurales de la mezcla de ramnolípidos obtenida.

La selección de las cepas degradadoras de petróleo, se realizó evaluando su crecimiento en placas con hidrocarburos como única fuente de carbono. La capacidad biodegradadora se estudió mediante un ensayo de biodegradación en medio líquido mineral con hidrocarburos y crecimiento de los aislados en placas con medio salino y naftaleno. La actividad se evaluó midiendo el halo de degradación (cm). ⁷

Los aislados rizosféricos con características de promotoras de crecimiento vegetal se seleccionaron atendiendo a la capacidad de producción de ácidos orgánicos, acetoína, solubilización de fosfatos, ácido indolacético y fijación de nitrógeno atmosférico.

La remoción de hidrocarburos de suelos contaminados se realizó mediante la técnica descrita por Urum et al (2006) ⁸ y mediante la técnica de bioaumentación en microcosmos (Nápoles 2005). ⁹ En el caso de aguas contaminadas se evaluó la aplicación de un consorcio bacteriano (Xanthomonas sp., Acinetobacter bouvetii; Shewanella sp.; Defluvibacter lusatiensis) obtenido en México y actualmente depositado en la Colección de Cultivos del CEBI. Los ensayos se realizaron en botellas que contenían 50 mL de agua de mar estéril (ME) y sin esterilizar (MSE), suplementados con 10 % de diésel e incubados en zaranda por 21 d. Este consorcio se utilizó en el biorreactor Airlift diseñado en el laboratorio para estos fines.

Para los ensayos de biodegradación de clorofenoles (ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2,4-D) se evaluaron las rizobacterias con características de promotoras del crecimiento vegetal. Se añadió 1 mL de inóculo a una concentración de 3 x 10⁸ UFC mL^-1 a frascos con 100 mL de medio mineral salino con 2,4-D como única fuente de carbono. El cultivo se desarrolló en zaranda a 30 °C.

La remoción de metales pesados de aguas contaminadas se evaluó aplicando ramnolípidos y bioadsorción con biomasa microbiana seca. Se utilizó una solución de ramnolípidos de 280 mg/L siguiendo la metodología descrita por Elouzi et al (2014). ⁽¹⁰

Los experimentos de adsorción se realizaron con 0,25 gL^-1 de biomasa seca (Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011), bajo agitación en zaranda a 175 rpm, pH 6,2 unidades y tiempo de contacto de 60 min.

Otra opción evaluada para remediar aguas contaminadas con metales pesados que a su vez contienen hidrocarburos fue la integración de los procesos de precipitación de metales pesados y biodegradación de petróleo por las bacterias Desulfovibrio sp. y Pseudomonas aeruginosa AT18 respectivamente, el cual fue realizado según el sistema experimental descrito en la figura 2, con el empleo de un sistema de reactores combinado aerobio/anaerobio/bioprecipitación. El reactor anaerobio (bioprecipitación) operó con un cultivo de Desulfovibrio sp. En fase de crecimiento exponencial, cuyo efluente se hace pasar por el reactor aerobio (biodegradación) conteniendo el medio mineral y los metales pesados Cr(III), Cu(II), Mn(II) y Zn a concentraciones de 60 mgL^-1, 50 mgL^-1, 50 mgL^-1 y 80 mgL^-1 respectivamente, y 2 % (v/v) de una suspensión celular de Pseudomonas aeruginosa AT18 (DO_600nm = 2), obtenida del pellet centrifugado (10 min, 5000 g) en fase exponencial. El seguimiento del cultivo se realizó durante los primeros 4 días cada 12 h y a partir de ahí cada 24 h, mediante la determinación de la concentración celular, pH, concentración de sulfato y concentración de sulfuro. ¹¹

El biosurfactante se cuantificó por el método colorimétrico de la Antrona previamente validado. ¹² Se tomaron 1,25 mL de medio libre de células y se mezclaron con 2,5 mL de reactivo (0,2 g de 9,10-dihidro-9-oxoantraceno por cada 100mL de ácido sulfúrico) en tubos de ensayos inmersos en agua fría (10-15 ºC). Se agitaron en vórtex, se colocaron durante 15 min en baño de agua a 100 ºC y se enfriaron a temperatura ambiente por 1 h. La determinación se realizó mediante curva de calibración (y = 0,0096x - 0,007, r² = 0,9975) utilizando soluciones patrones de ramnosa entre 10 y 70 μg mL^-1 preparados a partir de una solución de concentración 1 g/L^-1, los cuales recibieron el mismo tratamiento que las muestras. Se midió la absorbancia (Spectroquant Pharo 300 Merck) a 625 nm contra blanco de reactivo. La concentración de RL se calculó multiplicando los valores de ramnosa por el factor de corrección 3,4 para compensar la masa extra que representa la porción lipídica del RL.

Se realiza mediante la determinación de los TPH (Total Hydrocarbon Petroleum) por gravimetría, previa extracción líquido/líquido con n-hexano (1). ¹³ En todos los casos se corrigen las muestras respecto a un control y así se determina el porcentaje de biodegradación.

(1)

Posteriormente, la fracción alifática fue analizada en un cromatógrafo de gases Termoquest Trace 2000 con detector de ionización a la llama (FID) y columna capilar OBS de 30 m de longitud x φ_{i =} 0,25 mm de diámetro interno. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura inicial 50 ºC (1 min); gradiente de temperatura: 5 ºC min-1 hasta 320 ºC y a esta temperatura durante 10 min; temperatura detectora: 320 ºC; temperatura inyector: 290 ºC; flujo de Helio: 1,1 mL/min^-1; volumen de inyección: 1 μl. La integración de los picos se realizó con el software Chemcard y la representación gráfica de los cromatogramas se obtuvo con el software Sigmaplot 2,0. En la cuantificación de los picos se incluyó la UCM (unresolved complex mixture). Todas las muestras se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), con un cromatógrafo de gases HP5890 serie II y un espectrómetro de masas modelo HP5989A.

Las concentraciones de los metales se determinaron por espectroscopia óptica de emisión atómica mediante plasma de acoplamiento inductivo (ICP-AES) en un espectrómetro Ametek, Alemania. Para esto, las muestras se centrifugaron a 4500 rpm en centrifuga (Neofuge 5 Heal Force, China) durante 10 min; la solución sobrenadante se filtró por medio de jeringuillas con filtros Milipore acoplado (White GSWP, 0,22 ± 0,2 µm) de 20 mm de diámetro para eliminar los sólidos que pueden interferir en el análisis, los filtrados obtenidos se conservaron a 4 ºC hasta su posterior lectura.