Una nueva metalo carboxipeptidasa y un nuevo inhibidor bifuncional de serino/metalo proteasas aislados del anélido marino Sabellastarte magnifica: Estructura y función

Resumen

Las metalocarboxipeptidasas (CPs) son enzimas que desempeñan importantes funciones en los seres vivos lo que ha motivado el estudio de estas enzimas y sus inhibidores. En el presente trabajo se detectan, purifican y caracterizan estructural y funcionalmente dos nuevas moléculas presentes en el anélido Sabellastarte magnifica, una metalo carboxipeptidasa (SmCP) presente en el cuerpo y un inhibidor bifuncional de serino/metalo carboxipeptidasa (SmCI) presente en la corona de tentáculos. La identificación de estas proteínas se realizó mediante la combinación de métodos cinéticos convencionales con métodos proteómicos como el Intensity Fading MALDI-TOF MS. Ambas moléculas presentan características funcionales novedosas que las destacan dentro de las familias de proteasas e inhibidores a las que pertenecen. La enzima SmCP es una metalo CP de la familia M14A con masa molecular de 33.7 kDa, inhibida fuertemente por inhibidores típicos de CPs y representa la primera enzima descrita capaz de hidrolizar sustratos con aminoácidos hidrofóbicos y ácidos en el C terminal. Por su parte, SmCI es el primer inhibidor descrito en invertebrados marinos y el primer inhibidor bifuncional capaz de inhibir fuertemente a metalo CPs y proteasas serino como la tripsina y la elastasa pancreática. La combinación de la degradación de Edman y la obtención de su cDNA (número de acceso GenBank: AM283480) permitió la obtención de su secuencia de aminoácidos (número de acceso UNIPROT: P84875). SmCI es una glicoproteina de 165 aminoácidos, con una masa molecular de 19.7 kDa y 9 puentes disulfuro, formada por tres dominios BPTI/Kunitz. SmCI constituye la primera proteína BPTI/Kunitz capaz de inhibir CPs. Se obtuvo el inhibidor recombinante y su forma no glicosilada (SmCI N23A) sobre expresados en P. pastoris, lo que permitió confirmar las características bifuncionales del inhibidor natural. Se obtuvieron además variantes recombinantes del inhibidor: los bidominios D1D2 y D2D3, así como el tercer dominio (SmCI D3) para abordar estudios de relación estructura-función. La caracterización cinética de estas moléculas indicó que la inhibición de carboxipeptidasas, no involucra el extremo carboxilo de la molécula y que el D1 juega un papel esencial en esta inhibición. La estructura 3D del complejo SmCI N23A/hCPA4, demostró que SmCI presenta un mecanismo novedoso no canónico de interaccion con estas enzimas y que inserta su extremo amino en el centro activo de la enzima a diferencia a lo descrito para los inhibidores clásicos de CPs. En este trabajo se describe por primera vez la estructura 3D de una proteína tridominio de la familia BPTI/Kunitz. Además, se demuestra que se requiere la proteína tridominio para alcanzar la completa inhibición de CPA. Los estudios cinéticos frente a proteasas serino revelaron que solo rSmCI-D3 y el bidominio D2D3 son capaces de inhibir a tripsina, sugiriendo el papel fundamental del D3 en esta inhibición y que la inhibición de elastasa pancreática está determinada solo por el primer dominio.