Contribución al mecanismo de formación de poros de sticholisina I, una proteína formadora de poros de la anémona Stichodactyla helianthus, mediante el empleo de mutantes de Cys en zonas funcionalmente relevantes de la proteína

Resumen

Sticholisina I (St I) es una citolisina producida por la anémona marina Stichodactyla helianthus, que se caracteriza por formar poros oligoméricos en membranas naturales y artificiales. En este trabajo se describe la obtención por vía recombinante en Escherichia coli (E. coli) de una variante recombinante de St I (St Ir), así como su caracterización conformacional y funcional. Estos trabajos permitieron reducir el impacto ecológico que provoca la obtención de St I a partir de las anémonas como fuente natural y además realizar mutagénesis sitio-específica para su caracterización funcional. La ausencia de Cys en St I facilitó la introducción de este residuo aminoacídico, por mutagénesis dirigida, en zonas funcionalmente importantes de la toxina. En el trabajo se sustituyeron por Cys en St Ir de forma independiente, los aminoácidos Glu2 y Phe15 (localizados en el segmento de los primeros treinta aminoácidos que participan en la formación del canal) y la Arg52, Pro80 y Trp111 (en la región de interacción con las membranas). Así, se obtuvieron y purificaron de E. coli cinco proteínas mutadas: StI E2C, StI F15C, StI R52C, StI P80C y StI W111C. Los estudios de caracterización espectroscópicos permitieron establecer que las sustituciones aminoacídicas no provocaron cambios conformacionales en los mutantes con respecto a St Ir. Los monómeros de StI E2C, StI R52C y StI P80C mostraron capacidades similares de unión a las membranas en comparación con la variante recombinante. StI F15C mostró un ligero incremento en su capacidad de interacción con las membranas mientras que StI W111C resultó la de menor capacidad de unión. La capacidad formadora de poros de los monómeros, medida en vesículas liposomales y membrana eritrocitaria, resultó similar entre StI E2C, StI F15C y St Ir. Sin embargo, la actividad lítica de StI R52C, StI P80C y StI W111C disminuyó con respecto a St Ir. Los agregados diméricos por enlace disulfuro en StI R52C y StI W111C disminuyeron la actividad biológica de las proteínas. Una de las novedades científicas más importante del presente trabajo radica en que se demuestra que la presencia de agregados diméricos estabilizados por enlace disulfuro, en StI E2C, incrementa la actividad biológica formadora de poros tanto en vesículas liposomales como en eritrocitos. Estos resultados demuestran, por primera vez, que la unión covalente de los extremos aminos de St I potencia la formación de poros funcionales por un mecanismo hasta ahora desconocido. En la investigación se aportan nuevos elementos sobre la importancia de los residuos Glu2, Phe15, Arg52, Pro80 y Trp111 en las etapas de unión inicial a las membranas y de formación de poros durante el mecanismo lítico. Por último, la obtención de los mutantes de Cys abre las posibilidades para el marcaje de St I con sondas de espín o sondas fluorescentes para estudiar el mecanismo de formación de poros mediante las espectroscopias de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y de fluorescencia, y sustentan otras aplicaciones nanobiotecnológicas actualmente en desarrollo en nuestro grupo de trabajo.