Doble Fraccionamiento por Electroforesis en Geles de Poliaclilamida para el estudio de mezclas complejas de proteínas

Resumen

La identificación de proteínas de baja abundancia es uno de los retos actuales de la proteómica debido al amplio rango dinámico de expresión de proteínas en un sistema biológico. Para aumentar las posibilidades de detección de proteínas poco abundantes es esencial utilizar métodos de separación de proteínas o péptidos que reducen la complejidad de la muestra biológica. Los métodos de separación de proteínas se han basado fundamentalmente en técnicas electroforéticas como la focalización isoeléctrica y la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). La focalización isoeléctrica también ha sido aplicada para la separación de mezclas de péptidos. Sin embargo, no se ha investigado con anterioridad la utilidad de la electroforesis para el fraccionamiento de mezclas complejas de péptidos. En el presente trabajo se establece un nuevo método para estudios de proteómica denominado Doble Fraccionamiento por Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (DF-PAGE). El método combina el fraccionamiento de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio, la hidrólisis enzimática en el gel y la separación de péptidos por electroforesis en gel de poliacrilamida en ausencia de dodecil sulfato de sodio. Como aspecto novedoso se desarrolla, por primera vez, la técnica PAGE en ausencia de SDS para el fraccionamiento y la simplificación de mezclas complejas de péptidos. Además, se presenta, para esta técnica, un nuevo sistema discontinuo de soluciones tampón para la selección de péptidos ácidos (pI ≤ 5.5) y se desarrolla un dispositivo para la colección en solución de los péptidos fraccionados. El método DF-PAGE permite identificar mayor número de proteínas que la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio y la focalización isoeléctrica en solución. La aplicación del método DF-PAGE a la caracterización del principio activo de la vacuna VA-MENGOC-BC permitió identificar 67 proteínas que no se habían detectado previamente en este preparado vacunal. El método DFPAGE también se aplicó a la identificación de las proteínas moduladas diferencialmente por el péptido antitumoral CIGB-552 sobre la línea celular HT-29 de adenocarcinoma de colon. Los resultados arrojaron nuevas evidencias experimentales para la caracterización de las bases moleculares de la acción de este péptido. Los resultados de este trabajo están avalados por cuatro publicaciones científicas en las revistas Journal of Proteome Research, Electrophoresis, Journal of Proteomics y un capítulo solicitado por invitación de los editores en el libro Methods in Molecular Biology en la serie Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Estos resultados también han sido presentados en siete congresos internacionales.