Combinación de espectrometría de masas con punto isoeléctrico y determinación del aminoácido N-terminal de los péptidos para la mejor identificación de proteínas en estudios de proteómica

Resumen

La proteómica surge como consecuencia del desarrollo alcanzado por las técnicas suaves de ionización en la espectrometría de masas, fundamentalmente las conocidas como ESI y MALDI (del inglés electrospray ionization y matrix-assisted laser desorption ionization) que le permitió quedar directamente involucrada en la identificación de proteínas a partir de digestiones enzimáticas específicas. En estos veinte años de desarrollo la técnica evolucionó desde la identificación de una o varias proteínas aisladas en bandas de geles de electroforesis hasta el análisis masivo de mezclas complejas de péptidos y su identificación y cuantificación simultánea basada fundamentalmente en su espectro de masas MS/MS y la exactitud de la determinación de las masas moleculares tanto del ión precursor como de los iones fragmentos. Sin embargo la elevada complejidad para cualquier especie en muestras de estudios de proteómica sobrepasa la capacidad de separación y el poder de detección de los métodos más avanzados de la cromatografía líquida multidimensional y la espectrometría de masas. Por otra parte, los amplios rangos dinámicos de concentración de las distintas especies a analizar puede llegar a 10-12 órdenes lo que dificulta el análisis de las especies menos abundantes. La importancia de la función biológica de las proteínas no correlaciona con la abundancia por lo que en los estudios de proteómica tener acceso a proteínas cada vez menos abundantes es un reto omnipresente en el estado del arte. De la cantidad enorme de péptidos que se generan de cualquier proteoma, al ionizarlos en el espectrómetro de masas solamente una pequeña porción de las señales se seleccionan para los experimentos de MS/MS y de estos una buena parte no generan espectros de masas con una calidad suficiente para realizar su identificación confiable. Esto es particularmente notorio para péptidos derivados de proteínas menos abundantes. La aproximación de nuestro trabajo se basa en el uso combinado de la exactitud de la masa molecular, el punto isoeléctrico, la información del aminoácido ubicado en el extremo N, el tiempo de retención en la cromatografía de fase reversa, como criterios para la identificación de las proteínas, aún cuando no dispongamos de un espectro de masas MS/MS de elevada calidad. La combinación de estos datos con el uso de métodos de aislamiento selectivo de péptidos que permite analizar solamente péptidos con determinadas características en su secuencia también fue evaluada para incrementar la eficiencia de la identificación. Hasta el momento no se han usado estas características físico-químicas de los péptidos como criterio de identificación, el desarrollo fundamental ha sido desde el punto de vista tecnológico en la mejoría de la exactitud de los espectrómetros de masas, por lo que el uso combinado de estas características junto al espectro de masas, es totalmente novedoso. Los resultados principales de este trabajo son: 1. La evaluación combinada del punto isoeléctrico, el aminoácido N-terminal, el tiempo de retención, la determinación de masas moleculares exactas por espectrometría de masas y los métodos de aislamiento selectivo, como criterio de identificación, 2. El desarrollo de un algoritmo y programa para un cálculo más exacto del punto isoeléctrico de los péptidos, basado en el diseño de máquinas de soporte vectorial, cálculo que se realiza masivamente para todos los péptidos identificados. 3. La determinación del aminoácido N-terminal de cada péptido modificado con isotiocianato de fenilo en su extremo N a partir de la fragmentación en fase gaseosa y la determinación del ión b1 en el espectro MS/MS, procedimiento que ocurre en condiciones de alto flujo. 4. El desarrollo de un programa para la identificación masiva de proteínas basados en la serie b1 del espectro de masas y la exactitud de la masa molecular, y se demostró un incremento de un 20% de nuevas identificaciones. La novedad de este trabajo está en que: 1- se identificó la influencia que tiene el uso del punto isoeléctrico, el aminoácido N-terminal y el tiempo de retención en cromatografía de fase reversa, en combinación con la exactitud del espectro de masas, sobre la identificación de proteínas en estudios de proteómica, 2- se desarrolló un método y programa para la determinación masiva de punto isoeléctrico de los péptidos, que es más exacto que los métodos reportados, 3- se implementó un procedimiento para favorecer la determinación directa del aminoácido N-terminal de cada péptido a partir del fragmento b1 en el espectro de masas, posterior a su derivatización con PITC, 4- se desarrollaron varios programas de cómputo para la evaluación bioinformática de las bases de datos de péptidos y proteínas, 5- se elaboró un algoritmo y programa, que permite favorecer las identificaciones una vez se determine el aminoácido N-terminal, una secuencia parcial y su combinación con el espectro de masas, 6- se conformó una plataforma de trabajo que reduce los falsos positivos e incrementa el número de identificaciones en comparación con los programas más comúnmente usados.